白驳丸及其拆方对白癜风小鼠CD8~+T细胞及黑素细胞的影响 [复制链接]

曲保全 ，李若楠，  马慧可，朱昊玥，刘雨琛，李萍，赵京霞

【摘要】目的 探讨白驳丸及其拆方对白癜风小鼠CD8+T细胞及黑素细胞的影响。方法正常C57BL/6小鼠作为空白组,同品系小鼠随机分为模型组、阳性药组、白驳丸及其拆方组。除空白组外,其余各组均构建内源性自身反应性CD8+T 细胞靶向皮肤黑素细胞的白癜风动物模型。造模成功后,分别予以托法替尼、白驳丸及其拆方水溶液灌胃,空白组及模型组等量纯水灌胃,各组小鼠均灌胃10周。采用小型摄影棚及数码相机拍摄小鼠尾部皮肤,Image J图像处理后观察皮损脱色情况;采用全组织包埋免疫荧光观察皮损CD8+T细胞及黑素细胞数量及分布;采用流式细胞术观察皮损CD8+T细胞及黑素细胞比例及功能。结果 与空白组比较,模型组尾部皮损脱色面积增大,CD8+T细胞浸润及黑素细胞缺失增多,CD3+CD8*T、CD8* CD69*T、CD8+CXCR3+T细胞比例增加,CD45~CD117*黑素细胞比例下降。与模型组比较,白驳丸及其拆方可不同程度改善白癜风小鼠尾部皮损脱色情况,减少 CD8*T 细胞浸润及黑素细胞缺失,降低CD3*CD8*T、CD8+CD69*T、CD8*CXCR3+T细胞比例,增加CD45-CD117*黑素细胞比例;其中以白驳丸全方组效果最为显著,全方减养血活血通络药组效果最不明显。结论 白驳丸及其拆方可不同程度地抑制CD8+T细胞数量及功能，保护黑素细胞,改善白癜风小鼠尾部皮损脱色情况,其中养血活血通络药可能发挥核心作用。

【关键词】白驳丸;拆方;白癜风;CD8*T细胞;黑素细胞

【文献标识码】 A 【文章编号】2096-4382(2024)03-0273-08 【中图分类号】R 758.4*1;R 285

QU Baoquan、LIRuonan', MA Huike',ZHU Haoyue',LIU Yuchen', L Ping',ZHAO Jingxia

(1.Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University，Beijing Institute of Traditional Chinese MedicineBeijing Key Laboratory of Clinical Basic Research on Psoriasis,Beijing 100010,China;2.Clinical College,Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine、Beijing 100029,China )

【Corresponding author】ZHAO Jingxia,E-mail: zhaojingxia@bjzhongyi.com

[Abstract Objective To explore the effect of Baibo pills and its modified prescriptions on CD8*T cells and melanocytes in vitiligo mice.MethodsNormal C57BL/6 mice were used as the blank group, and the mice of same strain were randomly divided into one model group, one positive drug group, and one Baibo pills and its modified prescription groups. Except for the blank group, all other groups constructed vitiligo animal models with autoreactive CD8* T cells targeting skin melanocytes.After successful modeling,tofacitinib，Baibo pills and its modified prescriptions were administered by gavage, while the blank group and model group were given equal amounts of pure water. All mice were administered by gavage for 10 weeks.Using a small studio and digital camera to capture the tail skin of mice, and observing the depigmentation of skin lesions after Image Jimage processing.Whole mount immunofluorescence was used to observe the number and distribution of CD8+ T cells and melanocytes.Flow cytometry was used to observe the proportion and function of CD8 * T cells and melanocytes.Results Compared with the blank group,the model group showed an increase in the depigmentation area of tail lesions，infiltration of CD8 *T cells,and loss of melanocytes.The proportion of CD3* CD8+ T,CD8+CD69+ T,and CD8* CXCR3* T cells increased, while the proportion of CD45-CD117* melanocytes decreased.Compared with the model group,Baibo pills and its modified prescriptions could improve the depigmentation，reduce CD8* T cell infiltration and melanocyte deficiency,decrease the proportion of CD3* CD8+ T,CD8+ CD69* T，CD8* CXCR3* T cells, and increase the proportion of CD45-CD117* melanocytes to varying degrees. The effect of Baibo pills was the most significant, while the effect of Baibo Pills without nourishing blood, activating blood,and unblocking meridian herbs was the least significant. Conclusion Baibo pills and its modified prescriptions could inhibit the number and function of CD8 *T cells,protect melanocytes, and reduce the depigmentation of tail skin lesions in vitiligo mice to varying degrees.Nourishing blood, activating blood, and unblocking meridian herbs may play a core role.

  [Key words]Baibo pills;Modified prescriptions; Vitiligo;CD8*T cells; Melanocytes

  白癜风是一种常见的慢性自身免疫性皮肤病，典型临床特征是皮肤黏膜瓷白色斑片,境界清楚,常呈对称性分布,主要病理表现为皮损处CD8*T细胞特异性杀伤黑素细胞。白癜风作为一种损容性皮肤病,对患者正常工作、生活均造成一定阻碍,降低了患者生活质量,具有不可低估的社会心理影响。当前普遍认为白癜风的发生发展与干扰素-y(interferon-y,IFN-y)-趋化因子C-X-C基序配体9/10(C-X-C motif chemokine ligand 9/10,CXCL9/10)轴调控的细胞毒性CD8T细胞杀伤黑素细胞密切相关。

  白驳丸为我国近代中医皮科泰斗赵炳南先生博采民间经验所成,后制为水丸成为北京中医医院院内制剂并沿用至今。在多年的临床实践中,白驳丸治疗白癜风疗效明确,且无明显不良反应,但其发挥作用的具体机制及组方原则的科学内涵尚不明确。综合以上基础,本研究基于内源性自身反应性CD8T细胞靶向皮肤黑素细胞的白癜风动物模型，结合全组织包埋免疫荧光、流式细胞术等方法,探索白驳丸及其拆方对白癜风小鼠CD8T细胞及黑素细胞的影响,并对其组方原则进行科学阐释。

  1材料与方法

  1.1 动物与细胞

  雌性C57BL/6小鼠,7~9 周龄,体重18~22g,购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010。小鼠皮肤黑素瘤细胞(B16F10细胞)由北京生命科学研究所陈婷教授课题组惠赠。本实验经北京市中医药研究所实验动物伦理委员会批准(BJTCM-M-2024-02-05)。

  1.2 药物与试剂

  白驳丸及其拆方所含药材购自北京同仁堂连锁药店,中药饮片粉碎过筛,使用纯水将药粉稀释为中药混悬液,按照成人(60kg)临床等药量换算成小鼠灌胃药量。具体药物组成如下:白驳丸全方(BBW，当归、红花、赤芍、鸡血藤、首乌藤、蒺藜、防风、盐补骨脂、黑豆皮等,具体比例为2:2:2:2:2:4:2:1:2)，全方减养血活血通络药(BBW-YX,全方减当归、红花、赤芍、鸡血藤、首乌藤),全方减疏风散邪药(BBW-SF,全方减蒺藜、防风),全方减补肾药(BBW-BS,全方减盐补骨脂、黑豆皮)。

  托法替尼(辉瑞,H20181078)、抗小鼠CD4清除抗体(BioXCell,BE0003-1)、抗小鼠CD45(百进生物,103108)、抗小鼠CD3(百进生物,100220)、抗小鼠CD8a(赛默飞世尔,17008182)、抗小鼠CD117(碧迪生物,553355)、抗小鼠CD69(百进生物，104545)、抗小鼠CXCR3(百进生物,155904)、抗小鼠CD8a(百进生物,100712)、AF647抗大鼠IgG(杰克逊免疫,712-605-153)、抗小鼠Melan-A(艾博抗，ab210546)、AF488抗兔IgG(杰克逊免疫,711-545-152)。

  1.3 仪器与设备

  数码相机(ILCE-6000,索尼)、共聚焦显微镜(LSM780,蔡司)、流式细胞仪(CytoFLEX,贝克曼库尔特),离心机(3-18K,西格玛),双罐型动物麻醉机(R630-ECP,瑞沃德生命科技有限公司)。

  1.4 白癜风动物模型制备

  参照文献制备白癜风小鼠模型,该模型通过短暂接种B16F10细胞和消耗CD4*Treg细胞,激活靶向黑素细胞的内源性自身反应性CD8*T细胞;其尾部皮损可模拟白癜风的主要临床特征,包括表皮脱色、皮损CD8*T细胞浸润及黑素细胞缺失。

  将 B16F10细胞进行复苏培养,细胞达到50%~60%汇合时进行传代培养,传代3~5代后消化细胞制成细胞悬液。使用自动细胞计数器进行活细胞和总细胞计数,对于白癜风诱导的皮内注射方案,每只小鼠需要2x10°个B16F10活细胞,细胞活力≥95%。

  将B16F10细胞悬液浓度调整为1.6x103/μL,即每125μL 注射量含2x10°个B16F10活细胞。异氟烷麻醉小鼠,剃除右侧背毛,使用胰岛素注射器将125μL细胞悬液皮内注射至剃毛区域,记录为第0天。第4天,筛选肿瘤直径2~4 mm的小鼠进行后续实验,腹腔注射CD4清除抗体(10μg/g小鼠体重)。第10天,再次腹腔注射CD4清除抗体(剂量同前)。第12天,手术切除黑素瘤(肿瘤直径约10mm),并进行伤口缝合。

  1.5 分组与给药

  随机挑选6只小鼠作为正常对照组(Control)，不予造模。剩余36只小鼠模型制备完成后随机分为白癜风模型组(Vitiligo)、阳性药物(托法替尼，Tofa)组、BBW组、BBW-YX组、BBW-SF组、BBW-BS组,每组6只。自第21天开始灌胃。正常对照组及模型组灌胃纯水,阳性药物组灌胃托法替尼水溶液[2.143 mg/(kg.d)],BBW组、BBW-YX组、BBW-SF组、BBW-BS组根据药物比例分别灌胃不同剂量中药混悬液[2.460、1.230、1.722、2.091g/( kg・。每天灌胃1次,灌胃10周后,对小鼠进行指标观察与检测。

  1.6 检测指标及方法

  1.6.1 尾部皮损脱色情况应用小型摄影棚及数码相机对小鼠尾部皮肤进行拍摄,Image J图像处理后,观察各组小鼠白癜风样皮损脱色情况。

  1.6.2 尾部皮损CD8*T细胞及黑素细胞数量及分布 采用全组织包埋免疫荧光法。小鼠皮肤经脱毛、消化、真表皮分离、固定,应用CD8、Melan-A-抗和AF647、AF488荧光二抗孵育、封片。使用共聚焦显微镜采集分析图像,观察小鼠白癜风样皮损中CD8*T细胞及黑素细胞数量及分布。

  1.6.3 尾部皮损CD8*T细胞及黑素细胞比例及功能采用流式细胞术。小鼠皮肤经脱毛、消化、真表皮分离、消化,分别应用CD45、CD3、CD8、CD69、CXCR3及CD45、CD117 染色,使用流式细胞仪检测分析小鼠白癜风样皮损CD8*T细胞及黑素细胞比例及功能。

  1.7 统计学方法

  使用SPSS26.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示,两组间比较采用1检验;多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),进一步做两两比较用LSD方法。非正态分布样本采用秩和检验。计数资料使用x检验。P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1各组小鼠尾部皮损脱色情况

  小鼠尾部皮损脱色情况是白癜风疾病严重程度最直观的评判指标。结果显示,空白组小鼠尾部皮肤无白斑,而模型组尾部皮肤出现类似白癜风的色素脱失斑,脱色面积达70%左右(P<0.0001),见图1。相较于模型组,各药物组小鼠尾部皮损色素脱失均有不同程度的减轻,中药组以BBW组效果最为显著(P<0.0001),BBW-SF组(P<0.0001)及BBW-BS组(P<0.01)次之,而BBW-YX组效果不明显(P>0.05),见图1。

  2.2 各组小鼠尾部皮损CD8+T细胞与黑素细胞数量及分布

  全组织包埋免疫荧光检测可在组织病理层面反映小鼠尾部皮损CD8*T细胞与黑素细胞的数量与分布。结果显示,空白组皮损无明显CD8*T细胞，黑素细胞无缺失;而模型组CD8*T细胞浸润明显，黑素细胞大量缺失(P<0.0001)。相较于模型组，各用药组均可以不同程度地减轻CD8*T细胞浸润及黑素细胞缺失情况,中药组以BBW组效果最为显著(P<0.001),而BBW-YX组效果不明显(P>0.05),见图2。

  2.3 各组小鼠尾部皮损CD8+T细胞及黑素细胞比例及功能

  流式细胞术检测可在细胞层面反映小鼠尾部皮损不同功能的 CD8*T细胞与黑素细胞的比例。结果显示,与空白组比较,模型组CD3*CD8*T、CD8*CD69*T、CD8*CXCR3*T细胞表达升高明显(P<0.000 1),CD45-CD117黑素细胞表达显著降低(P<0.000 1)。相较于模型组,各用药组均可以不同程度地降低CD3*CD8+T、CD8*CD69*T、CD8*CXCR3*T细胞比例,增加CD45-CD117黑素细胞比例,中药组以BBW组效果最为显著(P<0.001),而BBW-YX组除可降低CD3*CD8*T细胞比例(P<0.05),其余改善均不明显(P>0.05),见图3~6。

  3 讨论

  白癜风,中医古籍中有“白处”“白驳风”等名称,如《诸病源候论》"记载:“白癜者,面及颈项身体皮肤肉色变白.与肉色不同,亦不痒痛,谓之白癜。”我国近代中医皮科泰斗赵炳南先生认为此病缘由七情内伤,肝气郁结,气机不畅,复感风邪,搏于肌肤,致令气血失和,而发本病”。白驳丸为赵老博采民间经验所成,方中当归、红花、赤芍、鸡血藤、首乌藤养血活血通络,蒺藜、防风疏风散邪,盐补骨脂、黑豆皮补肾。白驳丸临床疗效明确,但其发挥作用的具体机制及组方原则的科学内涵尚不明确。基于此,本研究将白驳丸拆分为养血活血通络药、疏风散邪药、补肾药,以全方减某组别药来观察白驳丸及其拆方对白癜风小鼠的协同或独特治疗作用。

  白癜风发病的免疫机制主要为IFN-y通过与成纤维细胞/角质形成细胞IFN-y受体相结合,激活其Janus 激酶(janus kinase,JAK)-信号转导和转录激活因子(signaltransducer and activator of transcription,STAT)通路,诱导产生趋化因子CXCL9/10,募集黑素细胞特异性CXCR3*CD8*T细胞向表皮迁移,并分泌颗粒酶B、穿孔素等发挥细胞毒性效应杀伤黑素细胞。此外,激活的CD8*T细胞可产生 IFN-y,创建一个正反馈环路,加剧自身免疫反应,驱动脱色区域逐步扩大和白癜风皮损的持续存在。

  本研究所采用的基于内源性自身反应性 CDT细胞靶向皮肤黑素细胞的白癜风小鼠模型,随着造模时间的推移,模型小鼠逐渐出现尾部皮肤色素脱失、躯体毛发变白,初始为散在斑片、后逐渐融合成片,与白癜风临床表现极为相似。相较于以往氢醌、莫诺苯宗外用刺激模型或转基因、注射外源性T细胞动物模型”,该制备方法所产生的靶向皮肤黑素细胞的CD8*T细胞为内源性、自身反应性,造模机制更贴合临床白癜风发病机制。由于C57小鼠躯干部皮肤表皮层不含黑素细胞(黑素细胞仅存在于毛囊中),而尾部皮肤表皮及毛囊均含有黑素细胞,与人体皮肤结构更为相似,故本研究选取尾部皮损进行检测。

  本研究使用白驳丸干预白癜风小鼠模型,结果发现白驳丸可减轻小鼠尾部皮损色素脱失,减轻CD8*T细胞浸润及黑素细胞缺失,同时可降低CD8*CD69*T、CD8*CXCR3*T细胞表达。CD69是CD8*T细胞早期活化标志物[18],而CD8*T细胞表面蛋白CXCR3可与趋化因子CXCL9、CXCL10相结合,从而促进CD8*T细胞迁移至表皮发挥黑素细胞杀伤作用,因此CD8*CD69*T、CD8* CXCR3*T细胞比例,可在一定程度上反映CD8+T细胞的活化及效应功能。本研究证明了白驳丸既可减少CD8T细胞数量,又可抑制CD8T细胞的活化及功能,从而减轻对黑素细胞的损伤,发挥白癜风治疗作用。

  通过拆方实验,本研究发现白驳丸全方组效果最佳,而全方减养血活血通络药组效果最差,提示养血活血通络在白癜风治疗中具有重要作用。关于白癜风核心病机,有“风邪搏于皮肤,血气不和”之论与“血瘀于皮里”之言,均强调了从血论治的重要性。白驳丸中当归、红花、赤芍、鸡血藤、首乌藤养血活血通络,气血得调补,经络得通畅,肌表自然得以濡养复色。同时本研究观察到,全方减疏风散邪药组及全方减补肾药组虽仍具有一定治疗作用,但均不及全方组效果显著,提示疏风散邪药及补肾药的联合效用亦不容忽视。白驳丸中蒺藜、防风疏风散邪,盐补骨脂、黑豆皮补肾,肌表风邪得散,肾精肾气充足,自可濡养温煦肌肤。以养血活血通络为法,辅以疏风散邪补肾,各组分中药协同配伍运用方可疗效更佳。

  综上,本研究证实“养血活血通络、补肾疏风散邪”的白驳丸可抑制CD8+T细胞数量及功能,保护黑素细胞,减轻白癜风小鼠尾部皮损色素脱失,并发现其中养血活血通络药可能发挥核心作用。但本研究对于白驳丸各组分药调节免疫的具体机制、主要成分及各成分之间的联合作用仍未明确,还需进一步探索研究。

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