马晶晶 亢盼 郭森 坚哲 李春英 李舒丽
空军军医大学西京皮肤医院，西安 710032
通讯作者: 李舒丽 E-mail shli@fmmu.edu.cn
摘要： 【摘要】 目的 探究转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式。方法 收集空军军医大学西京皮肤医院2020年1月至2022年12月明确诊断的5例进展期白癜风患者皮损组织，同时收集性别、年龄匹配的5例来源于整形外科手术剩余皮肤组织作为健康对照。培养永生化的健康人表皮黑色素细胞系PIG1、白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V及人表皮原代黑色素细胞，其中原代黑色素细胞分离自西京医院泌尿外科手术切除的3例健康男性包皮组织。采用组织免疫荧光检测TFAP2B、多巴色素互变异构酶（DCT）在健康对照皮肤和白癜风皮损中的表达及定位，细胞免疫荧光和Western印迹法检测TFAP2B在人表皮黑色素细胞中的表达。两组间比较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析法。结果 组织免疫荧光结果显示，TFAP2B仅在人表皮黑色素细胞中表达，且定位于细胞核。Western印迹结果显示，TFAP2B在人表皮黑色素细胞系PIG1及原代黑色素细胞中强表达（相对表达量分别为0.45 ± 0.05和0.36 ± 0.04）。组织免疫荧光结果显示，在10例人表皮组织（包括5例健康对照和5例白癜风）中，TFAP2B（623 917.5 ± 88 784.0）与DCT（2 232 655.3 ± 588 810.4）的荧光强度呈显著正相关（r = 0.91，P＜0.001）。此外，TFAP2B在白癜风皮损表皮黑色素细胞中相对荧光强度（0.12 ± 0.05）显著低于健康对照表皮黑色素细胞（1，t = 19.35，P＜0.001）。Western印迹结果显示，TFAP2B在白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V中的相对表达值（0.62 ± 0.09）亦显著低于PIG1细胞（1，t = 5.92，P＜0.027）。结论 TFAP2B在人表皮黑色素细胞中特异性高表达，其表达与黑色素细胞标记分子DCT的表达呈显著正相关，在白癜风患者表皮黑色素细胞中明显低表达。
关键词: 白癜风, 黑素细胞, 表皮, 转录因子AP-2, 多巴色素互变异构酶, 表达模式
基金资助:国家自然科学基金数学天元基金——琶洲实验室（黄埔）“数学与医疗健康交叉重点专项”（PZLABHP-02-2023K0605）；国家自然科学基金（12126606、82273517、82173414）
doi:10.35541/cjd.20230369
Expression patterns of transcription factor TFAP2B in epidermal melanocytes in healthy individuals and vitiligo patients Ma Jingjing, Kang Pan, Guo Sen, Jian Zhe, Li Chunying, Li Shuli
Department of Dermatology, Xijing Hospital, Air Force Medical University, Xi′an 710032, China
Corresponding authori Shuli,Email shil@fmmu.edu.cn
Abstract: 【Abstract】 Objective To explore expression patterns of transcription factor TFAP2B in epidermal melanocytes of healthy individuals and vitiligo patients. Methods Lesional tissues were collected from 5 patients confirmedly diagnosed with progressive vitiligo at the Department of Dermatology, Xijing Hospital, Air Force Medical University from January 2020 to December 2022. At the same time, some discarded normal skin tissues were obtained from 5 gender- and age-matched healthy individuals after plastic surgeries. The immortalized healthy human epidermal melanocyte cell line PIG1, the vitiligo epidermal melanocyte cell line PIG3V, and primary human epidermal melanocytes, which were isolated from the discarded foreskin tissues of 3 healthy males after urological surgeries in Xijing Hospital, were cultured in vitro. Tissue immunofluorescence assay was performed to determine the expression and localization of TFAP2B and dopachrome tautomerase （DCT） in healthy skin tissues and vitiligo lesions, and cell immunofluorescence assay and Western blot analysis were conducted to determine the TFAP2B expression in human epidermal melanocytes. Comparisons between two groups were performed using t test, and correlation analysis was performed using Pearson correlation coefficients. Results Tissue immunofluorescence assay showed that TFAP2B was specifically expressed in human epidermal melanocytes and localized in the nuclei. Western blot analysis showed that TFAP2B was strongly expressed in the human epidermal melanocyte cell line PIG1 and primary melanocytes, with the relative expression levels being 0.45 ± 0.05 and 0.36 ± 0.04, respectively. Tissue immunofluorescence analysis showed that the fluorescence intensity of TFAP2B （623 917.5 ± 88 784.0） was significantly and positively correlated with that of DCT （2 232 655.3 ± 588 810.4; r = 0.91, P < 0.001） in human epidermal tissues from 5 healthy controls and 5 vitiligo patients. In addition, the relative fluorescence intensity of TFAP2B in epidermal melanocytes was significantly lower in the vitiligo lesions （0.12 ± 0.05） than in the healthy skin tissues （1, t = 19.35, P < 0.001）. Western blot analysis showed that the relative expression level of TFAP2B was also significantly lower in the PIG3V cells （0.62 ± 0.09） than in the PIG1 cells （1, t = 5.92, P < 0.027）. Conclusions TFAP2B was specifically and highly expressed in human epidermal melanocytes, and its expression level was significantly and positively correlated with that of the melanocyte marker DCT. Additionally, TFAP2B was obviously lowly expressed in the epidermal melanocytes of patients with vitiligo.
Key words: Vitiligo,Melanocytes, Epidermis, Transcription factor AP-2, Dopachrome tautomerase, Expression pattern
Fund programs:National Natural Science Foundation of China, R&D Project of Pazhou Lab (Huangpu) under Grant（PZLABHP-02-2023K0605）; National Natural Science Foundation of China （12126606, 82273517, 82173414）
DOI:10.35541/cjd.20230369
表皮黑色素细胞起源于神经嵴,位于表皮基底部。转录因子TFAP2家族(transcription factor AP-2)是神经嵴发育的主调节子,同时参与颅面部发育，其突变可导致颅面部发育异常,出现鳃裂眼面综合征和Char综合征。TFAP2B是TFAP2家族成员之一,其多肽序列由N末端富含脯氨酸的反式激活结构域、DNA结合结构域和C末端螺旋跨螺旋结构域组成,介导转录激活或抑制。最新研究显示，TFAP2B在斑马鱼黑素干细胞中特异性表达,是黑素干细胞生成黑色素细胞所必需的转录因子。通过检索Human Protein Atalas数据库,我们发现在人皮肤组织不同类型细胞中,TFAP2BmRNA在黑色素细胞中呈特异性高表达,表达值为180.4 nTPM(normalised transcripts per million reads,归一化后每百万序列中的转录本)。以上数据提示,TFAP2B在黑色素细胞发育及功能中具有重要作用。然而，TFAP2B在人类表皮黑色素细胞中的表达模式尚不清楚,在白癜风中的作用更无相关报道。本研究通过检测TFAP2B在健康人表皮黑色素细胞和白癜风皮损黑色素细胞中的表达及定位,明确其表达模式。
材料与方法
一、材料
1.皮肤标本:白癜风皮损标本来自空军军医大学西京皮肤医院2020年1月至2022年12月明确诊断的5例进展期非节段型白癜风患者,包括男2例，女3例,年龄25~39岁,病程1~120个月,近3个月未使用系统性药物治疗,近1周未使用外用药物成光疗。同时收集与白癜风患者性别,年龄匹配的5例健康对照皮肤组织,来自空军军医大学西京医院整形外科手术剩余皮肤组织。本研究通过空军军医大学西京医院医学伦理委员会批准(批件号:KY2033160-1),受试者均签署知情同意书。
2.人表皮黑色素细胞:水生化的健康人表皮黑色素细胞系PIG1及白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V由芝加哥大学Caroline Le Poole博士惠赠。人表皮原代黑色素细胞分离自西京医院泌尿外科手术切除的3例健康男性包皮组织。
3.主要试剂:免抗人TFAP2B多抗(美国Novus公司),小鼠抗人酪氨酸相关蛋白2/多巴色素互变异构酶(dopachrome tautomerase ,DCT)单抗(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗人黑色素瘤抗原(melanoma antigen,Melan-A)多抗(美国Abcam公司),Alexa Fluor 488-山羊抗兔、Cy3-山羊抗小鼠(美国Abcam公司),小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多抗为江苏康为世纪生物科技股份有限公司产品,Hoechst33258染液、RIPA裂解液为上海碧云天生物技术有限公司产品。辣根过氧化物酶偶联的二抗(美国Millipore公司),高敏ECL化学发光底物为苏州四正柏生物科技有限公司产品。254培养基及人黑色素细胞生长因子(美国Invitrogen公司),分散酶、胎牛血清(美国Gibco公司)。
二、方法
1.组织免疫荧光检测TFAP2B、DCT在黑色素细胞中的表达:取白癜风皮损和健康对照皮肤组织,4%多聚甲醛固定过夜,次日经浸蜡、包理、切片,再脱蜡至水、抗原修复,山羊血清封闭1h,演加TFAP2B(稀释比1:200)与DCT(稀释比1:50)一抗混合液:4℃孵育过夜,次日磷酸盐缓冲液洗3遍，滴加相应的二抗混合液(稀释比1:200),避光室温孵育1h,磷酸盐缓冲液洗3遍,滴加Hoechst33258染液(稀释比1:1000),避光室温孵育15min,磷酸盐缓冲液洗涤,50%甘油封片,共聚焦荧光显微镜下观察并采集图像。用ImageJ软件定量测定TFAP2B与DCT在黑色素细胞中的荧光强度。TFAP2B在健康对照表皮黑色素细胞中的相对表达值设为1,其在白癜风皮损黑色素细胞中的相对表达值=白癜风皮损黑色素细胞中的荧光强度/健康对照表皮黑色素细胞中的荧光强度。
2.细胞免疫荧光检测TFAP2B在黑色素细胞中的表达IG1细胞与人原代黑色素细胞接种于玻底培养皿,次日4%多聚甲醛固定10 min,山羊血清封闭1h,滴加TFAP2B与Melan-A一抗混合液(稀释比1:200),4℃孵育过夜,余步骤同组织免疫荧光,无需封片,细胞置磷酸盐缓冲液中用共聚焦荧光显微镜观察并采集图像。
3.原代黑色素细胞的分离:收集3例20岁以下健康男性包皮组织,去除皮下脂肪,剪成条状,加0.25%分散酶4℃过夜消化分离真表皮,将表皮剪碎,0.25%胰酶37℃消化15min,加含血清培养基终止消化,200目滤网过滤,100xg离心5min,培养液洗涤细胞1次,254培养基(含青-链霉素、黑色素细胞生长因子及5%胎牛血清)重悬,接种于培养瓶中,于37℃CO恒温培养箱中培养。
4.细胞培养IG1细胞、PIG3V细胞及原代黑色素细胞培养于添加人黑色素细胞生长因子及5%胎牛血清的254培养基中,并置于37℃ CO2恒温培养箱中。
5.Western印迹法检测TFAP2B在PIG1、原代黑色素细胞及PIG3V细胞中的表达IG1、原代黑色素细胞及PIG3V细胞分别用RIPA裂解，12 000xg,4 ℃离心15 min后取上清液,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿转法转移蛋白于聚偏二氟乙烯膜上,用TFAP2B抗体或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3- phosphatedehydrogenase,GAPDH)抗体4℃孵育过夜,与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗杂交,采用ECL化学发光系统显色,ImageLab软件分析显色条带灰度值。TFAP2B蛋白相对表达量=TFAP2B条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。TFAP2B在PIG1细胞中的相对表达值设为1,在PIG3V细胞中的相对表达值=PIG3V细胞中的表达量/PIG1细胞中的表达量。
6.统计学方法:应用Graphpad Prism5软件,正态分布的计量资料用x±s表示,两组间比较采用t检验,相关性分析采用Pearson相关分析法。P<0.05认为差异有统计学意义。
结果
一、TFAP2B在健康人表皮黑色素细胞中的表达
组织免疫荧光检测显示,健康人表皮组织中，黑色素细胞位于表皮基底部,TFAP2B仅在DCT阳性黑色素细胞中表达,位于细胞核,见图1。
细胞免疫荧光检测显示,体外培养的黑色素细胞系PIGI及原代黑色素细胞中,TFAP2B在细胞核中强表达,见图2。Western印迹显示,TFAP2B在PIGI细胞与原代黑色素细胞中强表达(图3A),其相对表达量分别为0.45±0.05和0.36±0.04。
二、TFAP2B与黑色素细胞标记分子DCT表达水平的相关性相关性分析显示,10例人表皮组织(包括5例健康对照和5例白癜风)中,DCT在黑色素细胞中的荧光强度(2232 655.3±588 810.4)与TFAP2B荧光强度(623 917.5±88784.0)呈显著正相关(r=0.91,P<0.001),见图4。
三、TFAP2B在白癜风皮损及白癜风表皮黑色素细胞系PIG3V中的表达TFAP2B在健康对照表皮黑色素细胞中强表达,相对表达值为1;而在白癜风皮损表皮中明显低表达(图1),相对表达值为0.12±0.05,两组比较差异有统计学意义(t=19.35,P<0.001)。Westem印迹结果显示,TFAP2B在PIG1中的相对表达值为1,在PIG3V中为0.62±0.09,两组差异有统计学意义(t=5.92,P=0.027)。见图3B。
讨论
TFAP2家族由A~E五个成员组成,最早发现调控黑色素细胞发育的成员是TFAP2A。特异性敲除小鼠神经嵴中TFAP2A基因,不仅导致神经管闭合缺陷、颅面发育迟缓及中耳发育异常,而且腹部、尾部及爪部毛发变白”。在斑马鱼中敲除TFAP2A基因能抑制黑色素细胞存活、迁移及分化。在小鼠胚胎中同时敲除TFAP2A与TFAP2B基因可导致黑色素细胞几乎完全缺失。最新研究显示,TFAP2B是斑马鱼黑素干细胞生成黑色素细胞所必需的转录因子,由此我们推测TFAP2B在人黑色素细胞发育中扮演重要角色。
在健康人皮肤组织样本中,我们发现TFAP2B仅在表皮黑色素细胞中高表达,与Human ProteinAtalas数据库中结果一致。在体外培养的黑色素细胞系PIG1细胞及原代黑色素细胞中,TFAP2B强表达,且定位于细胞核,与组织中表达结果相互印证。目前TFAP2B在人皮肤组织中的表达模式尚未见报道,我们首次揭示了TFAP2B在人皮肤组织黑色素细胞中高表达且具有特异性,提示其在黑色素细胞发育中可能具有重要作用。多巴色素互变异构酶DCT,也称酪氨酸酶相关蛋白2,是酪氨酸酶基因家族成员之一,在黑色素细胞中特异性表达,参与黑素合成及皮肤着色。我们分析TFAP2B与DCT在人表皮黑色素细胞中的荧光强度值,结果显示,二者在表皮黑色素细胞中的表达呈显著正相关,结合TFAP2B也在表皮黑色素细胞中呈特异性表达,我们推测TFAP2B是一个新的黑色素细胞标记分子,但仍需大样本研究来验证。
白癜风是一种易感基因与应激引起的皮肤色素脱失性疾病,以皮肤白斑和各种并发疾病为特征,其临床指标如皮损面积、色素深浅等通常滞后于疾病严重程度,现有治疗方式尚不能达到满意的复色效果。本研究以上结果引发我们思考FAP2B是否参与白癜风的发病?进一步比较TFAP2B在健康人皮肤与白癜风皮损表皮黑色素细胞中的表达水平,结果显示,TFAP2B在白癜风皮损表皮黑色素细胞中的表达水平显著低于健康对照，提示TFAP2B的异常表达可能通过影响黑色素细胞存活或功能参与白癜风发病。综上我们发现,TFAP2B在人皮肤组织的表皮黑色素细胞中特异性高表达,其表达水平与黑色素细胞标记分子DCT的表达呈显著正相关,并且TFAP2B在白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达明低于健康人表皮黑色素细胞,它可作为一个潜在表皮黑色素细胞标记分子,为研究黑色素细胞发育及白癜风发病机制提供新思路。本研究已明确TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式,其在黑色素细胞发育和功能中的具体作用及机制尚需进一步深入研究,为白癜风的治疗提供理论依据和新靶点。
利益冲突 所有作者均声明无利益冲突
作者贡献声明 马晶晶:实验操作、论文撰写;亢盼:论文修改,经费支持;郭森:统计学分析;坚哲:经费支持;李春英:研究指导;李
舒丽:研究指导,论文修改
参考文献
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http：//www.nngglt.com/showtopic-1226.aspx
基于LC-MS非靶向代谢组学分析进展期白癜风血清代谢物差异
http：//www.nngglt.com/showtopic-1227.aspx
生物制剂治疗白癜风进展
http：//www.nngglt.com/showtopic-1228.aspx
进展期白癜风患者肠道微生物菌落构成及功能特征
http：//www.nngglt.com/showtopic-1235.aspx
莫诺苯宗联合维甲酸对C57BL/6小鼠及SCF转基因小鼠模拟白癜风的作用
http：//www.nngglt.com/showtopic-1234.aspx
白癜风系统及外用靶向免疫治疗进展
http：//www.nngglt.com/showtopic-1236.aspx
白癜风与病毒感染的关联
http://www.nngglt.com/showtopic-1237.aspx
CO2点阵激光联合氟尿嘧啶复方倍他米松注射液导入治疗白癜风的临床观察
http://www.nngglt.com/showtopic-1252.aspx
白癜风靶向药物临床应用进展及前景
http://www.nngglt.com/showtopic-1253.aspx
白癜风代谢重塑：进展和未来
http://www.nngglt.com/showtopic-1254.aspx
白癜风光疗复色模式的临床观察及其影响因素分析
http://www.nngglt.com/showtopic-1255.aspx
回顾性分析电解白发联合毛囊移植治疗25例毛发部位白癜风的疗效
http://www.nngglt.com/showtopic-1256.aspx
进展期非节段型白癜风患者对系统糖皮质激素治疗反应的相关影响因素研究
http://www.nngglt.com/showtopic-1257.aspx
水刀磨削或电动磨削联合负压吸疱自体表皮移植术治疗白癜风的疗效比较
http://www.nngglt.com/showtopic-1258.aspx
特瑞普利单抗治疗黑素瘤后发生白癜风样白斑1例
http://www.nngglt.com/showtopic-1259.aspx
误诊为白癜风的头部硬化萎缩性苔藓1例
http://www.nngglt.com/showtopic-1260.aspx
疑匹伐他汀致白癜风患者出现褐黑色斑点1例
http://www.nngglt.com/showtopic-1261.aspx
转录因子TFAP2B在健康人及白癜风患者表皮黑色素细胞中的表达模式
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