马冰砚 董丽萍 陆晓云 汪生 覃诗纯 汪锐 李梅 肖风丽
摘要：目的 研究进展期白癜风患者与健康人血清中的差异代谢物.方法 招募进展期白癜风患者59例和健康对照58例.采用高效液相色谱——质谱联用仪器检测非靶向血清代谢物.经主成分分析,偏最小二乘法判别分析等方法筛选相关差异生物标志物,利用KEGG数据库对筛选的差异代谢物进行注释和通路富集.结果 在进展期白癜风患者以及健康对照的血清样本中检测出336个代谢物,在两组血清样本之间存在10种显著差异代谢物.与对照组相比,下调代谢物包括:胡椒碱和泛酸;上调代谢物包括:1-硬脂酰基甘油、硬脂酰乙醇酰胺、咪唑乙酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、油酰乙醇酰胺、胆红素和尿苷.与差异性代谢物显著相关的关键代谢通路为不饱和脂肪酸的生物合成通路(P＜0.05).结论 本研究利用代谢组学分析,发现进展期白癜风患者和健康人血清代谢产物差异性以及特征化合物,为揭示白癜风发病机制提供基础,为临床辅助疾病诊断、治疗及预后提供新的视角.
关键词：白癜风;进展期;液相色谱质谱;非靶向;代谢组学;血清;差异代谢物
分类号：R758.41 [文献标志码] A 【文章编号】 1001-7089（2023）06-0652-05
[DOI] 10.13735/j.cjdv.1001-7089.202211114
Metabolite Difference Analysis for Vitiligo Serum Based on LC-MS Untargeted Metabolomics
MA Bingyan,DONG Liping,LU Xiaoyun., WANG Sheng,QIN Shichun, WANG Ruil ,LI Mei1·,XIAO Fengli,
(1. Department ofDermatology,the First Affiliated Hospital,Hefei 230022,China;2. Institute of Dermatology,Anhui Medical University,Hefei 230022,China;3.The Center for Scientific Research of Anhui Medical University,Hefei 230022,China)
[Corresponding author] XIAO Fengli，E-mail xiaofengli@126.com
[Abstract]Objective To concentrate on the differential metabolites in the serum of progressive vitiligo patients and healthy controls.Methods Fifty-nine vitiligo patients and 58 healthy volunteers in this study were recruited.Liquid chromatography-mass spectrometry was utilized to identify the distinction of metabonomics between serum tests of progressive vitiligo patients and healthy control group. Screening important differential biomarkers by principal component analysis, partial least squares discriminant analysis and other methods.Utilizing the KEGG database to annotate differential metabolites and enrich pathways.Results A total of 336 metabolites in serum samples from progressive vitiligo patients and controls were recognized. Ten critical metabolites were being found.Piperine and pantothenic corrosive was altogether diminished in patients. Eight metabolites were remarkably elevated, including1-stearoylglycerol,stearoyl ethanolamide,imidazoleacetic acid, stearic acid，cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid,oleoyl ethylamide,bilirubin and uridine. The critical metabolic pathway with the high connection of various metabolites was the biosynthesis pathway of unsaturated fat acids(P<0.05).Conclusion This study initially reveals the differences and distinct compounds of serum metabolites between progressive vitiligo patients and healthy people of the perspective of metabolomics. It gives a premise to additionally investigating the pathogenesis of vitiligo,as well as another viewpoint to help the conclusion,treatment and visualization in clinical practice.
[Key words]Vitiligo;Advanced stage;Liquid chromatograph mass spectrometer(LC-MS);Non-targeted;Metabonomics;Serum;Differential metabolites
白癜风(vitiligo)是一种常见的自身免疫性皮肤病,主要表现为皮肤和黏膜的色素脱失。白癜风的病期分为进展期和稳定期;临床中根据白斑面积分病级分为轻度(<1%体表面积),中(1%~5%体表面积),中重度(6%~50%体表面积)，重度(>50%体表面积)"。该病病因不明,目前研究表明其与免疫、遗传、环境暴露等因素相关。近年来,越来越多的证据表明代谢异常与包括白癜风在内的自身免疫性疾病相关。
代谢组学是继基因组、蛋白组研究最下游小分子代谢物的新兴手段,常用于研究各种疾病引起的代谢特征。但因白癜风病因复杂、临床分型较多,目前对白癜风患者的代谢谱知之甚少。近期,靶向代谢组学报道表明,氨基酸和脂质的代谢紊乱与白癜风患者的生理和病理变化相关;非靶向代谢组学报道表明,非节段性白癜风患者血浆样本LPC、PAF、琥珀酸、CXCL4和CXCL7 等多种促炎因子显著升高。为了找寻更多的差异性代谢物，本实验扩大样本量,选用总体灵敏度更高的血清样本,利用液相色谱-质谱(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)结合非靶向代谢组学技术分析进展期白癜风患者与健康对照间的血清代谢组学特征,筛选出更多的差异性代谢物及代谢通路，试图为白癜风的诊疗提供新的研究方向。
1 对象与方法
1.1 研究对象 于2020年10月-2021年6月期间,在安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科门诊招募白癜风患者,诊断基于皮肤色素脱失斑和伍德灯(Wood 灯)检查,由两名皮肤科医生同时对患者进行诊断和病情评估。健康对照志愿者来自于本院体检中心。收集资料包括性别、年龄、家族史、既往病史、病程、临床表现、疾病活动性、治疗等。患者人组标准:①进展期白癜风患者:根据2021版中国白癜风诊疗共识,参考白癜风疾病活动度(VIDA)评
分、临床特征、同形反应和 Wood 灯四个指标,满足其中之一即为进展期;②无精神类疾病及重大代谢类疾病;③近1个月无系统用药史及光疗史;④近1周清淡饮食。对照人组标准:①无其他皮肤病;②无自身免疫疾病、精神类疾病、重大代谢类疾病;③近1个月内无用药史;④近1周清淡饮食;⑤白斑面积>1%。在研究对象签署知情同意书后，抽取其空腹晨血2mL于常规生化促凝管中，离心后-80℃冰箱冻存,待检测。本研究得到安徽医科大学伦理审查委员会的批准(伦理审批号PJ2022-04-25)。
1.2研究方法
1.2.1 仪器与试剂 甲醇、乙腈(德国Sigma公司),Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher 公司),Q-Exactive plus 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国 Thermo Fisher 公司)。
1.2.2实验方法取血清样本120μL 于1.5 mL聚丙烯塑料离心管中,加入乙腈萃取,经震荡离心转移上清至新管中,室温下氮气流吹干。100 μL 复溶液复溶,涡旋混匀后经 0.22 μm 有机滤膜过滤,滤液装入棕色进样小瓶中待测,在每个待测样本中吸取等量液体混匀制作内部质量控制(quality control，QC)。使用梯度模式下以 300μL/min 的流速提供的二元流动相进行20min梯度洗脱实现色谱分离后,进行 LC-MS 分析。
1.2.3 数据分析 采用 Thermo Scientific™ Com-pound Discoverer™软件处理本研究的质谱数据。使用SERRF构建随机森林模型消除误差矫正 QC 后，采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚类分析对白癜风样本和健康样本进行差异代谢物分析。通过单因素分析确定两组样本间的差异倍数[Fold change，FC=AVERAGE(实验组)/
AVERAGE(对照组)]，P值=TTEST(实验组,对照组,2,2);Bonferroni矫正P值以及多元变量统计模型的VIP 值来筛选差异代谢物,以FC>1.2或者FC<0.83,矫正P<0.05,VIP>1作为筛选差异代谢物的条件。对筛选出的差异代谢成分进行聚类分析并绘制热图,并利用 KEGG 数据库进行代谢物代谢通路注释。
2结果
2.1研究对象的基本特征 如表1所示,白癜风组及健康对照组年龄、性别、身体质量指数(body massindex，BMI)匹配,之间无显著差异;白癜风组均处于疾病进展期且白斑面积均>1%，病程(6.87 ±7.60)年。
2.2代谢组学实验结果稳定性分析 经LC-MS质谱分析和 QC 矫正后,对进展期白癜风患者和健康对照者血液样本间的正负离子模式分别进行PCA和OPLS-DA分析,结果显示,无监督 PCA 模型下分离趋势不明显(图1a~1b),经过监督的 OPLS-DA模型显示较好的分离效果(图1c~1d);200 次置换检验(permutation test)提示实验结果稳定,可重复性好(图1e~1f)。
2.3进展期白癜风组及健康对照组间差异性代谢物的筛选 经分析,共发现10个差异代谢物。与对照组相比,显著下调的差异性代谢物包括胡椒碱(piperine)和泛酸(pantothenic acid);显著上调的物质包括:1-硬脂酰基甘油(1-stearoylglycerol)、硬脂酰乙醇酰胺(stearoyl ethanolamide)、咪唑乙酸(imidazo-leacetic acid)、硬脂酸(stearic acid)、二十碳五烯酸(cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid)、油酰乙醇酰胺(oleoyl ethylamide)、胆红素(bilirubin)和尿苷(uridine)(图2)。
2.4差异代谢物通路预测结果 利用Metabo Ana-lyst 5.0 平台结合KEGG数据库对差异性代谢物进行分析。经鉴定的10个差异代谢物可映射出8条代谢通路,其中不饱和脂肪酸的生物合成代谢通路在两组间差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。
3 讨论
白癜风是一种皮肤黑素细胞缺失而导致明显白斑的自身免疫性皮肤病,色素代谢异常在该病发生发展中起着重要作用。代谢组学主要研究各种代谢路径的底物和产物的小分于代物，可以作为疾病诊断和预测的生物标志物。既往研究表明，失调的脂肪酸代谢途径可能参与白癜风的发病机制[7-8]。为进一步探究白癜风患者体内代谢谱失衡特征,笔者对中度及以上进展期白癜风患者进行血清非靶向代谢组学的分析，部分揭示了白癜风患者的血清代谢谱特征。
本研究发现,进展期中度以上的白癜风患者血清中存在不饱和脂肪酸代谢通路失衡。既往研究发现,高脂肪饮食会增加患白癜风的风险;同时，血清中的硬脂酸及总脂肪酸的代谢谱与多种自身免疫性疾病(包括白癜风)发病相关，可以作为疾病早期诊断的辅助工具。氧化应激在白癜风发病中起到一定作用，其导致外泌体和炎性细胞因子的释放，从而激活免疫反应攻击黑素细胞，促进疾病发展。游离脂肪酸,如硬脂酸,二十碳五烯酸,会导致高活性氧簇和活性氮簇生成增多,从而启动氧化应激机制。本研究发现,硬脂酸和二十碳五烯酸代谢异常,并且富集在白癜风患者的不饱和脂肪酸代谢通路，这与已发表的文献一致，提示此异常通路可能参与白癜风中氧化应激反应的启动从而促进疾病的发生发展,但其具体机制仍需进一步探究。
同时,本研究发现进展期白癜风组泛酸含量下降。泛酸也称维生素B5，是维持生命所必需的水溶性维生素,是形成三羧酸循环和脂肪酸代谢的关键辅助因子辅酶A所必需，因此其缺乏可能会影响脂肪酸代谢,引起白癜风患者体内的不饱和脂肪酸代谢失衡，促进疾病的发生。
目前有文献表明,胡椒碱可促进黑素细胞黑色素的生成，调节免疫，可刺激体外黑素细胞复制，有助于治疗白癜风。本研究表明,进展期白癜风患者相比健康对照血清中胡椒碱含量显著下降，推测可能是患者饮食中胡椒碱的摄入不足或者吸收障碍有关,在未来对白癜风患者的饮食中补充胡椒碱可能成为本病治疗的有利手段之一。
咪唑乙酸,在人体中参与组氨酸代谢,是组胺的代谢产物。有文献报道,组胺参与免疫炎症,并且在一些白癜风的发病中起重要作用,从而促进产生伴瘙痒的色素减退斑。结合本研究中咪唑乙酸含量的上升,推断组胺代谢增多可能引起色素脱失。因此,后续可进一步探究白癜风患者与组胺代谢的相关性。
氧化应激和免疫失衡在白癜风的发病机制中起重要作用,胆红素是一种强大的抗氧化剂,也被认为是自身免疫性疾病的保护因子。本研究结果表明,进展期血清中胆红素增高,故推测随着病情进行,胆红素可能作为免疫调节剂在机体中上调来调控免疫反应,但仍需深人探索其机制。
硬脂酰乙醇酰胺和油酰乙醇酰胺,这二者均是具有镇痛和抗炎特性的内源性脂质介质。它们的升高，可能是机体对白癜风进展过程发生的大量免疫炎症反应的调控。同时有文献报道,硬脂酰乙醇酰胺可促进细胞凋亡,故推测白癜风患者体内硬脂酰乙醇酰胺含量升高可能会促进黑素细胞凋亡,进而引起色素脱失。
本研究存在不足之处:①本研究仅为横断面研究,虽出现了许多有意义的结果,但缺乏大样本及前瞻队列研究;②仅考虑了进展期白癜风患者,尚未纳人稳定期患者,疾病代表性较小,有可能漏掉了有关该疾病的重要代谢特征;③采用非靶向LC-MS 检测技术,未对代谢物进行定量分析;④对差异性代谢物及其通路的预测并未加以验证。这些是本课题组后续需要完善和探索的方向。
本研究通过LC-MS 技术首次对中国汉族人群进展期白癜风患者血清代谢组学进行研究,发现 10种异常代谢物及不饱和脂肪酸生物合成通路与本病相关,探讨了部分代谢产物的病理生理能,为进一步研究白癜风提供了更多的线索。
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